剖析|你想要知道的數字PCR應用及前景
一． PCR的發展歷史
PCR技術自問世以來，在遺傳病、病原體、癌基因等分子診斷領域和法醫鑒定等方面發揮了巨大作用。代 PCR在進行擴增后通過凝膠電泳進行定性分析。
隨著生物分子熒光技術的發展，1992年實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR) 應運而生。qPCR是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質熒光強度來測定每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環后產物總量的方法。由于在PCR擴增的指數時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數存在線性關系，所以Ct值也就成為定量的依據。基于熒光探針或染料的第二代 PCR 技術隨后逐漸發展為檢測核酸目標片段的主流分子診斷學技術。
在實時定量 PCR（qPCR） 過程中，熒光信號隨著擴增產物的積累而增強。qPCR 能夠實時獲得模板擴增的熒光值，然后根據DNA 模板在指數增長時期的 Ct 值與標準 DNA 的Ct值比較來計算初始模板的濃度。但是這種方法由于是大體積反應系統，非特異性的擴增增加了假陽性結果和背景信號，因此，終無法獲得定量的結果。
隨著MEMS工藝的不斷成熟和微流控技術的不斷發展，新一代PCR技術，數字PCR(digital PCR, dPCR) 也隨之出現。digital PCR是一種新的定量PCR，主要是對PCR反應物進行有限稀釋，隨后在不同的反應腔室里進行PCR擴增，后根據泊松分布原理及陽性微滴的個數與比例得出靶分子的起始拷貝數或濃度的技術。
圖1. PCR技術的發展歷程
二． 數字微流控（dPCR）的原理
20 世紀末，Vogelstein 等提出數字PCR( digitalPCR，dPCR) 的概念，通過將一個樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應單元，每個單元包含一個或多個拷貝的目標分子( DNA 模板) ，在每個反應單元中分別對目標分子進行PCR 擴增，擴增結束后對各個反應單元的熒光信號進行統計學分析。
dPCR是一種核酸分子定量技術。
dPCR一般包括兩部分內容，即PCR擴增和熒光定量分析。
在PCR 擴增階段，與傳統技術不同，dPCR一般需要將樣品稀釋到單分子水平，并平均分配到幾萬個反應腔室里反應。這樣子相當于變相的對靶基因進行富集。與此同時，由于對原樣品的大幅度的稀釋，使得PCR抑制劑濃度顯著降低，這樣dPCR對初始PCR反應物里抑制劑的要求顯著低于qPCR。
不同于 qPCR對每個循環進行實時熒光測定的方法，dPCR 技術是在擴增結束后對每個反應單元的熒光信號進行采集，后根據泊松分布原理及陽性微滴的個數與比例得出靶分子的起始拷貝數或濃度。
圖2. dPCR基本原理
三. dPCR與qPCR的對比
相對于熒光定量PCR（qPCR）而言，dPCR具備以下優勢：
1、 靈敏度可達單個核酸分子：檢測限低至0.001%，原因在于dPCR可以實現靶標DNA/RNA的富集；
圖3. dPCR可以實現痕量核酸的高靈敏檢測
2、 無需標準品（標準曲線），即可對靶分子起始量進行定量；
3、 特別適合基質復雜樣品的檢測：終點PCR檢測，不依賴Ct值，不依賴擴增效率，能克服PCR抑制劑的影響，適合動血樣、FFPE組織、糞便、尿液、痰液、水樣、土壤、植物等復雜樣品中DNA的定量；
4、 能夠有效區分濃度差異（變化）微小的樣品：更好的準確度、精密度和重復性，可以用于測定靶基因的相對表達，基因拷貝數變異分析等。
圖4. qPCR和dPCR的對比
四．dPCR的多指標檢測的實現
如同qPCR一樣，dPCR中實現多指標的并行檢測能顯著降低檢測成本，獲取更豐富的檢測信息。
不同于qPCR中的多腔室擴增與多熒光通道結合的并行PCR方式，在dPCR里，一個微反應腔室里一般只含一種靶基因。
圖5. dPCR的多指標并行檢測的實現方式
所以dPCR的多指標檢測主要通過以下兩種方式實現：
1. 多個熒光通道。使用多種熒光染料來標記不同的要檢測的靶基因。
2. 單波長多強度。使用一種熒光染料，但是擴增結束時不同的靶基因對應的染料的熒光強度不一樣。
五．dPCR的分類以及相關的產品
微流控芯片技術能夠快速并準確地將樣品流體分成若干個獨立的單元, 從而進行多步平行反應，并且具有成本低、體積小和高通量等特點，是理想的數字PCR平臺。按照其獨立的單元的實現方式來細分，dPCR又分為基于液滴微流控（droplet microfluidics）的微滴數字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）和基于芯片式微流控的微陣列芯片式PCR。
5.1微滴數字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）
微滴數字PCR主要是將兩種互不相溶的液體，以其中一種作為連續相（油），另一種作為分散相（水），在水/油兩相表面張力和剪切共同作用下分散相以微小體積單元的形式存在于連續中，從而成液滴。這種液滴式的反應腔室具有體積小、樣品間無擴散等優勢。
在ddPCR中，利用微滴發生器可以一次生成數萬乃至百萬個納升甚至皮升級別的單個油包水微滴，作為數字 PCR 的樣品分散載體。這里，液滴中包裹了單拷貝DNA模板和PCR反應液，然后將液滴收集在PCR反應管中進行擴增。ØPCR反應結束后檢測每個微滴的熒光信號。
目前Bio-Rad公司的QX100系統、QX200系統均為采用液滴技術的數字PCR系統。
圖6. Bio-Rad的droplet digital PCR系統
5.2 微陣列芯片式PCR
微陣列芯片式PCR主要通過芯片設計將納升液體封閉在高通量的微池或微量通道中進行后續的PCR擴增及擴增后結果的熒光顯微鏡直接判讀。
按芯片設計方式，微陣列芯片式PCR又可以分為陣列微池式芯片、滑片式芯片和集成微泵閥芯片：
1. 陣列微池式芯片上刻蝕有微池陣列，反應液由進樣孔直接導入個反應微池；
2. 滑片式芯片是設計帶有微流體通道和反應單元的玻璃芯片，上下兩篇玻璃芯片間用油相密封，通過滑動芯片將樣品溶液從液體通道引入反應單元，同時生成成百上千個微反應滴陣列；
3. 集成微泵閥式芯片是通過多層軟刻蝕技術在聚二甲基硅氧烷（PDMS）芯片上加工交織的液體和氣體通道結構，通過地控制微泵閥的開啟和關閉，快速并準確地將流體分成若干個陣列的獨立單元。
2010年，Life Technologies也推出了基于陣列微池式芯片的數字PCR產品線–OpenArray系統。它提供的TaqMan OpenArray 數字PCR試劑盒可在OpenArray平板上運行。平板可在現有的OpenArray 實時定量PCR系統以及新上市的QuantStudio™ 12K Flex儀器上運行。OpenArray 實時定量PCR系統能夠同時運行3塊OpenArray平板。
圖7. TaqMan® OpenArray® Digital PCR系統
Fluidigm公司于2006年底推出了基于集成流體通路（IFC）芯片的Bio-Mark™ 高通量基因剖析系統。
其創新在于集成液體通路技術：應用集成電路制造工藝（光刻）在硅片或石英玻璃上刻上許多微管和微腔體，經過不同的控制閥門控制溶液在其中的活動來完成生物樣品的分液、混合、PCR擴增。
圖8. Bio -Mark™ IFC芯片
六．dPCR的應用前景
6.1 痕量核酸檢測
圖 9. 痕量核酸檢測的具體分類
dPCR尤其適合：對靈敏度要求非常高的核酸痕量分析研究；基質復雜樣品中的核酸準確定量（如組織、體液、排泄物等樣品）。
圖10. 痕量核酸檢測相關方法比較
6.1.1 癌癥標志物稀有突變檢測
在一份給定的樣本中，相比于野生型DNA，癌癥相關的突變序列比例較低，經常無法檢測。而憑借其*高靈敏度，dPCR系統可以很容易地定量分析低至0.001%-0.0001%的突變頻率。之前用任何方法都無法實現準確穩定檢測的樣本，現在可以使用dPCR輕松進行定量分析。
是否能夠開發出有效的靶向治療藥物，與突變基因的檢測密切相關。其中（1）攜帶藥物作用突變位點的癌細胞百分比；（2）突變的特定等位基因是否可以被準確檢測到，這兩點都直接影響到靶向治療是否有效。很顯然，在腫瘤均質細胞內檢測單一突變相對簡單，但是如果在異質組織內，在僅存有少量突變存在的情況下，如何準確檢測出突變/稀有變異，或者針對于同一種癌癥中多種亞克隆的準確鑒定，對個性化醫療的發展是一個巨大的挑戰。
案列1. 實現肺癌相關的表皮生長因子受體（EGFR）中T790M突變的檢測，可以更好地評估抗酪氨酸激酶抑制劑的治療。然而，由于其他技術檢測靈敏度有限，無法在高背景EGFR野生型中可靠地檢測到T790M突變。研究人員使用dPCR技術開發出度很高的檢測方法，以準確定量T790M的濃度[1]。
圖11. ddPCR可以用EGFR突變的肺癌患者的血漿中游離DNA（cfDNA）為樣本，檢測與EGFR敏感性和藥物抗性相關的突變
6.1.2 致病微生物檢測
的病毒載量分析對于闡釋疾病病程，后續治療及療效評估是至關重要的。病毒載量的波動，即使只下降了非常低的水平，意義卻是顯著的。在對病原體的研究中，能否實現準確而可靠的病毒DNA或RNA定量分析，關系到實驗的成敗。
案列2. 研究人員比較了 qPCR 和 dPCR 方法檢測臨床樣本中殘留的人類免疫缺陷病毒（HIV），其中包括功能性治愈的HIV感染嬰兒。研究人員發現，在檢測百萬個細胞內的 HIV DNA拷貝數時，相比于 qPCR，dPCR 的靈敏度提升了5倍；在檢測病毒長末端重復序列時，dPCR比qPCR靈敏提升了20倍[2]。
案列3. 研究人員探索HBV血清學和ddPCR檢測結果與肝細胞癌（HCC）臨床分期和病癥之間的關系中，ddPCR成功的克服了real-time PCR（qPCR）在檢測FFPE處理的肝癌患者組織樣品中HBV DNA時，遇到的準確度、靈敏度和重復性不足的缺點。進而得出以下結論： 1、ddPCR的靈敏度和準確度比real-time PCR更高——131個待測樣品中HBV DNA濃度范圍為1.1~175.5 copies/ul； 2、即使是在24個血清學檢測呈陰性的樣本中也檢測到了痕量的HBV DNA； 3、樣品中HBV DNA的含量與肝細胞癌（HCC）組織的臨床分期一致； 4、ddPCR技術可以用于肝癌的早期無創診斷，病程監控，肝移植、化療或免疫抑制的療效評估[3]。
6.2 與新一代測序（NGS）的無縫對接
相對于NGS， dPCR可以富集待測序樣品中的靶基因; dPCR還可以驗證 / 定量測序結果。
圖12. ddPCR和NGS的優勢互補
案列4. 由于人間充質干細胞（MSC）在人體內的含量極低，所以目前應用于臨床治療的MSCs都來源于體外培養。研究人員分別對體外培養p1，p8和p13階段（passage）的來源于人骨髓MSC采用全基因組測序(WGS)。WGS結果顯示在p1和p8階段的培養細胞中沒有拷貝數變異（CNV）和非常低頻的單核苷酸突變(SNV)，但是p13階段的SNCs數目顯著增加，達到677個。采用ddPCR對WGS發現的8個非同義突變進行了確認，結果發現在未經培養的單核細胞內就含有極低頻對應的突變(0.01%)，在p1和p8階段培養的MSC內其突變比例依然處于極低比例狀態(0.1-1%)，但是在p13培養的階段對應突變的比例顯著地上升到(17-36%)[4]。
6.3 基因表達分析
實時熒光定量PCR 常用于檢測基因表達差異，但該方法一般只能檢測出兩倍或者更大的差異。而一些研究則需要檢測低于兩倍的表達變化。dPCR 的檢測精度可達±10%甚至更高，能夠分辨更小的差異。
dPCR尤其適合：基因相對表達變化差異較小（<2倍）的研究；低豐度基因或單細胞的表達分析，以及RNA編輯、等位基因差異表達等研究。
圖13. 基因表達分析相關方法比較
6.4 拷貝數變異分析
圖14. 拷貝數變異
拷貝數變異 (CNV) 分析的目的是確認目的序列的拷貝數是否偏離野生型序列，以及偏差多少。拷貝數變異與疾病（癌癥）、代謝途徑、生物種進化等關系密切。臨床上，CNV可為具體治療方案的制定與修正提供參考；農業及畜牧業，CNV可作為遺傳育種的遺傳標記。
傳統實時熒光定量PCR平臺提供了足夠的分辨率，可以鑒別低拷貝數 (如0至5的拷貝數)；但更高的拷貝數需要更的測量，以確定確切的拷貝數。dPCR尤其適用于更高拷貝數分析，檢測精度*過±10%。
